Интенсификация животноводства, характеризующаяся высокой концентрацией поголовья в ограниченном пространстве, создает специфические экологические условия, способствующие накоплению и циркуляции разнообразных микроорганизмов [1, 2]. Среди них особую значимость имеют грибы, способные не только вызывать микозы у животных, снижая продуктивность и приводя к экономическим потерям, но и выступать в роли источников аллергенов и микотоксинов, формируя профессиональные и экологические риски для персонала [3,4]. Контаминация объектов животноводческой среды плесневыми и дрожжеподобными грибами создает предпосылки для ухудшения санитарно-гигиенических показателей продукции и устойчивой циркуляции условно-патогенных видов в замкнутой системе предприятия [5].

Ключевыми резервуарами и векторами передачи микобиоты в животноводческих комплексах являются воздух рабочей зоны, поверхности оборудования и конструкций, корма и подстилочный материал. Воздушная среда является основным путем распространения спор, в то время как контаминированные корма и подстилка обеспечивают прямое поступление микромицетов в желудочно-кишечный тракт и постоянное обсеменение кожных покровов животных [6,7]. Сложность контроля грибковой контаминации усугубляется формированием устойчивых к дезинфектантам биопленок на поверхностях и широким использованием противогрибковых препаратов, способствующих селекции резистентных штаммов [8, 9].

Несмотря на актуальность проблемы, комплексные исследования, одновременно оценивающие контаминацию различных экологических ниш (воздух, поверхности, корма, подстилка) на объектах животноводства и дающие фенотипическую характеристику выделенных грибковых изолятов, остаются недостаточно представленными в научной литературе. Подобный системный подход необходим для разработки эффективных санитарно-профилактических мероприятий и рекомендаций по контролю микологической безопасности.

Целью исследования было выполнить комплексную оценку уровня грибковой контаминации воздушной среды и поверхностей в различных производственных зонах животноводческих предприятий и дать характеристику выделенных изолятов дрожжеподобных грибов по чувствительности к распространенным противогрибковым препаратам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на базе нескольких типичных животноводческих комплексов Республики Башкортостан, специализирующихся на молочном и мясном скотоводстве.

Отбор проб осуществляли в основных технологических зонах: помещениях для откорма скота, телятниках, секциях для содержания молодняка, телок и бычков, а также в доильных залах и отстойниках. Для контроля показателей обследованы помещения административного назначения и столовая.

Весь цикл исследования, от процедур отбора, транспортировки и хранения проб до лабораторных этапов посева, культивирования, идентификации грибковых изолятов и определения их чувствительности к противогрибковым препаратам, выполнен в соответствии с действующей нормативно-правовой базой.

Мониторинг проведен в широком спектре производственных зон, различающихся по ключевым технологическим параметрам — плотности размещения поголовья, половозрастным группам животных, специфике рационов и производственному назначению. Отбор проб для анализа был синхронизирован с ключевыми технологическими циклами (раздача кормов, уборка навоза, погрузочно-разгрузочные работы с кормами и т. д.) для оценки реальной операционной контаминации.

Контаминацию воздуха оценивали седиментационным открытым способом (чашки Петри с питательными средами: мясо-пептонный агар, среда Эндо, желточно-солевой агар, кровяной агар, Энтерококкагар и среда Сабуро (ФБУН «ГНЦ ПМБ»; Россия)) и аспирационным методами с использованием микробиологического пробоотборника. Отбор проводили на высоте 1,5 м от пола в центральной части помещения и в зонах повышенного риска (у кормовых столов, навозных проходов) с экспозицией от 10 до 30 мин.

Смывы и смывочные отпечатки отобраны со стандартной площади (100 см²) с технологического оборудования (поилки, кормушки), элементов ограждений, стен, пола и вентиляционных решеток с использованием стерильных тампонов, смоченных в физиологическом растворе или растворе пептона.

Для получения репрезентативной средней пробы сыпучих и силосуемых кормов применен метод «конверта». Точечные пробы (8−10 единиц) отбирали из различных точек исследуемого объема, включая периферийные и центральные участки, а также из верхнего, среднего и нижнего горизонтов. При отборе проб из силоса и сенажа предварительно удаляли поверхностный слой толщиной 30−50 см для исключения деградировавшей массы. Все точечные пробы были объединены в стерильной емкости, тщательно гомогенизированы для формирования средней лабораторной пробы. Число проб кормов (n = 9) определялось числом производственных зон, выделенных на предприятии в соответствии с технологическим регламентом. Такой объем выборки обеспечил охват всех основных технологических групп животных и позволил провести сравнительную оценку уровня контаминации различных зон.

Пробы подстилочного материала (подстилки) отбирали в стерильные герметичные контейнеры с использованием стерильного инструментария. Схема отбора предусматривала выборку по диагонали помещения из шести точек. В каждой точке производили забор материала после снятия верхнего слоя с рабочей глубины 5−10 см, характеризующейся максимальной микробиологической активностью. Из каждой точки отбирали порцию массой около 100−200 г, после чего все порции объединяли в один общий стерильный контейнер для формирования объединенной пробы. Число проб подстилки (n = 7) определялось числом секций в производственном корпусе, одновременно соответствующих всем критериям включения в исследование (идентичные условия содержания, срок эксплуатации, физиологическая группа животных). Отбор проводили в рамках одного технологического цикла содержания, что исключало временной фактор как дополнительную переменную. Такой объем выборки позволил провести статистический анализ вариабельности микобиоты подстилки в пределах однородных производственных условий. Критерии исключения: участки с видимыми очагами увлажнения, плесени или локальной дезинфекции (менее 24 ч).

Контейнеры с пробами помещали в сумку-холодильник, время доставки в лабораторию не превышало 6 ч с момента взятия пробы.

Для выделения и идентификации дрожжей рода Candida выполняли посев исследуемого материала на микробиологические среды: Сабуро (ФБУН «ГНЦ ПМБ»; Россия), агар Сабуро с глюкозой и хлорамфениколом (HiMedia; Индия), Сабуро с мальтозой (ФБУН «ГНЦ ПМБ»; Россия) и хромогенный агар (HiMedia; Индия) ля дрожжевых и плесневых грибов. Ферментативную активность дрожжей определяли на средах с 1%-й пептонной водой и индикатором (Андреде, бромтимоловый синий (ФБУН «ГНЦ ПМБ»; Россия)) по общепринятым методикам. Культивирование проведено с соблюдением требуемых условий: чашки с посевами дрожжеподобных грибов инкубировали при температуре 28 ± 2 °C в течение 48–72 ч. Микробиологические исследования плесневых грибов проводили с использованием питательной среды № 2 ГРМ (Сабуро) (ФБУН «ГНЦ ПМБ»; Россия), хромогенного агара (HiMedia; Индия) для дрожжевых и плесневых грибов при 25^˚ С. Длительность культивирования составила 5–7 суток, с ежедневным просмотром. Для медленнорастущих грибов срок инкубации продлевали до 10 суток. Идентификацию проводили с использованием определителей микроскопических грибов с оценкой морфологии, формы, размера и наличия характерных структур.

Для контроля правильности идентификации дрожжеподобных грибов (рода Candida) и плесневых грибов (рода Aspergillus) использовали референтные штаммы из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) — Candida albicans  АТСС 10231 и Aspergillus niger АТСС 16404. Доля подтвержденных изолятов составила не менее 10% от общего числа выделенных культур.

Для оценки значимости потенциального патогена учитывали результаты исследования в титре не менее 10⁵ КОЕ/тампон. 

Исследование антимикотической чувствительности проведено для всех выделенных дрожжеподобных грибов рода Candida семейства Saccharomycetaceae из проб воздушной и производственной среды. Всего проанализировано 65 изолятов, распределенных, как показано в табл. 1.

Для оценки чувствительности дрожжей использовали агар Мюллера−Хинтона (MХА) (HiMedia; Индия) — модифицированный, для определения чувствительности к антимикотикам по стандарту CLSI, рекомендуемый для диффузии противогрибковых агентов, которыми пропитаны бумажные диски, в агаровый гель, как описано в стандарте CLSI. Определение критериев противогрибковой активности проводили диско-диффузионным методом с применением коммерческих дисков с антимикотическими  препаратами   для  определения чувствительности  in vitro HiMedia; Индия). Использовали расширенную панель дисков, содержащих различные концентрации шести антимикотических препаратов (флуконазол, клотримазол, кетоконазол, нистатин, амфотерицин В, итраконазол), выраженные в мкг/диск или ЕД.  Результаты оценивали по диаметру зоны задержки (отсутствия) роста микроорганизмов вокруг дисков согласно «Инструкции по использованию дисков с противогрибковыми препаратами» (табл. 2) и по таблицам рекомендаций МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 2025-01, раздел 2 «Диско-диффузионный метод оценки чувствительности дрожжей к противогрибковым лекарственным средствам»).

Из суточной культуры (24 ч при 35 ± 2^˚С) для каждого штамма готовили инокулюм, соответствующий по мутности стандарту МакФарланда 0,5, что соответствовало содержанию клеток (1×10⁶–5×10⁶ КОЕ). На поверхность питательной среды в чашках Петри в трех направлениях наносили по 1 мл полученной суспензии. Спустя 15 мин после инокуляции на агар помещали диски с противогрибковыми препаратами.

Инкубацию чашек осуществляли при 35 ± 2˚С, в обычной атмосфере для C. albicans и в атмосфере 5% СО₂ для C. krusei и С. glabrata. Достоверными результаты считали при образовании на чашках почти сливного роста культуры и равномерно круглых зон задержки роста. Если этого не наблюдалось через 20−24 ч роста, учитывали результаты через 48 ч. Для измерения зон подавления роста использовали линейку. Чашки Петри с закрытой крышкой располагали дном кверху на темной матовой поверхности так, чтобы свет падал на нее под углом 45˚ (учет в отраженном свете).

Контроль качества исследований на всех этапах проводили согласно рекомендациям МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 2025-01). Для контроля качества оценки чувствительности дрожжей к противогрибковым лекарственным средствам использовали специальные рекомендованные в соответствии со стандартом CLSI контрольные штаммы, полученные из коммерческих источников (ФБУН «ГНЦ ПМБ»): C. albicans АТСС 10231, C. albicans АТСС 24433. В каждую серию анализов (день проведения тестирования) включали контрольные штаммы. Посев контрольных культур и тестируемых изолятов проводили в идентичных условиях на одни и те же партии питательных сред. Серию анализов считали валидной, если диаметры зон задержки роста для контрольных штаммов соответствовали диапазонам, установленным производителем дисков (табл. 3). Если значения выходили за пределы контрольного диапазона, результаты серии не учитывали, а анализ повторяли.

При применении диско-диффузионного метода к культуре C. albicans АТСС 10231 диаметры зон задержки роста составили: для амфотерицина В ― 15,9 ± 1,7 мм, нистатина ― 19,6 ± 2,6 мм, клотримазола ―15,5 ± 1,7 мм, кетоконазола ― 19,6 ± 1,3 мм, итраконазола ― 19,6 ± 1,2 мм, флуконазола ― 32,7 ± 3,7 мм. На культуре C. albicans АТСС 24433: для амфотерицина В ― 14,8 ± 1,6 мм, нистатина ― 20,9 ± 1,4 мм, клотримазола ― 22,2 ± 3,3 мм, кетоконазола ― 24,4 ± 3,8 мм, итраконазола ― 18,9 ± 0,9 мм, флуконазола ― 32,1 ± 3,3 мм. Полученные значения соответствуют контрольным диапазонам для референс-штамма, что подтверждает валидность проведенного эксперимента.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программного пакета Statistica 10.0 (StatSoft; США) и табличного процессора Microsoft Excel (Microsoft; США). Для оценки значимости ассоциаций между категориальными переменными (вид гриба, тип объекта, уровень резистентности) использовали критерий хи-квадрат (χ²) Пирсона для таблиц сопряженности. В случае нарушения предположения о достаточной величине ожидаемых частот (когда более 20% ячеек имели ожидаемую частоту < 5 или хотя бы одна ячейка имела E < 1) применяли точный двусторонний критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микробиота воздушной среды рабочей зоны помещений представлена двумя основными группами — дрожжеподобными и плесневыми грибами (рис. 1).

Микробиологический анализ проб, отобранных в разных помещениях рабочей зоны, показал, что родовой и видовой состав микобиоты практически одинаковый, однако процентное соотношение варьирует в зависимости от отделения. Типовыми представителями патогенной и условно-патогенной микобиоты, которых наиболее часто выявляли при скрининге, были Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, A. niger, C. albicans, C. krusei, C. grabrata, Candida tropicalis. Распределение указанных микроорганизмов по частоте высевания в пробах, а также доля в структуре условно-патогенной микрофлоры были схожими в помещениях, находившихся в сходных экологических условиях, имевших сходные показатели загрязнения агробиоценозов (рис. 2).

Исследование смывов производственной среды свидетельствует о том, что во всех рабочих зонах комплекса присутствуют плесень и грибы, преимущественно представленные A. niger и C. albicans. A. niger больше всего выделяли в помещениях телятника — в 35,7% и в цехе содержания бычков — в 24,3% случаев, C. albicans — в помещении содержания молодняка (в 42,81% случаев) и в отстойнике (в 45,39% случаев).

В видовом отношении среди плесневых грибов помимо A. niger идентифицированы такие плесневые грибы, как A. flavus, A. fumigatus, а помимо C. albicans выделены C. krusei, C. grabrata, C. tropicalis, причем все эти виды грибов обнаружены во всех помещениях рабочей среды, но в разном процентном соотношении. Другие представители грибковой микобиоты, Mucor spp., Penicillium spp., Fusarium, встречались в менее 1% проб.

Проведенный нами анализ свидетельствует о том, что все исследованные пробы кормов контаминированы плесневыми и дрожжеподобными грибами. Вид A. niger идентифицирован в 90% проб, тогда как A. flavus и A. fumigatus обнаружены в 10% образцов. В половине случаев (50% проб) отмечена смешанная контаминация, представленная двумя видами плесневых грибов одновременно.

Наиболее сложный микробный ценоз, представленный двух- и трехкомпонентными ассоциациями, зарегистрирован в пробах кормов из помещений для содержания молодняка, бычков и отстойника. В образцах из секции молодняка идентифицированы ассоциации Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii и Enterobacter aerogenes. В кормах из помещения для бычков выделены Escherichia coli, Proteus vulgaris и Enterobacter aerogenes, а в пробах из отстойника — E. coli и Citrobacter freundii. В структуре выделенных микроорганизмов идентифицировали и E. aerogenes — в 20% проб.

Среди всех выделенных условно-патогенных микроорганизмов наибольший удельный вес имеют плесневые и дрожжеподобные грибы, что может говорить о неудовлетворительном хранении кормов и недостаточной санитарной обработке помещений рабочих зон производственной среды (рис. 3).

Грибковая микрофлора в составе подстилочного материала представлена плесневыми грибами, где в 100% проб выделены A. flavus, A. fumigatus и A. niger. Среди дрожжевых грибов в 100% проб выделена C. albicans. Реже высевались C. krusei и C. grabrata. C. tropicalis не обнаружен ни в одной из проб подстилочного материала (рис. 4).

Анализ частоты выделения дрожжеподобных грибов рода Candida выявил существенные различия в зависимости от типа исследуемого объекта. Максимальная обсемененность (100%) зафиксирована в пробах кормов и подстилочного материала. В смывах данный показатель составил 36%, что выше, чем в пробах воздуха, где частота выделения была минимальной и достигала 22%. Установленная зависимость частоты детекции Candida spp. от типа субстрата является значимой (p < 0,001), что свидетельствует о значимо более высокой вероятности обнаружения грибов в кормах и подстилке по сравнению с воздухом и смывами. Все выделенные микроорганизмы встречались в виде многокомпонентных ассоциаций с другими видами бактерий.

Анализ резистентности 65 выделенных штаммов грибов рода Candida к шести антимикотическим препаратам выявил выраженную межвидовую вариабельность. При сравнении чувствительности различных видов Candida (A vs. G и K vs. G) (табл. 4) значимых различий обнаружено не было (во всех случаях p > 0,05).

Наибольшая эффективность in vitro отмечена для нистатина и клотримазола. Доля изолятов C. albicans, чувствительных к нистатину, составила 92,5% (95% ДИ: 80,1–97,4), к клотримазолу — 87,5% (95% ДИ: 73,9–94,5). Для C. krusei максимальная активность зафиксирована у кетоконазола (93,8%; 95% ДИ: 71,7–98,9) и нистатина (93,8%; 95% ДИ: 71,7–98,9).

Наименьшую эффективность продемонстрировал флуконазол: доля резистентных штаммов C. albicans достигла 70,0% (чувствительность составила лишь 30,0%; 95% ДИ: 18,1–45,4). Чувствительность не-albicans видов (C. krusei и C. glabrata) к флуконазолу также была низкой (56,3 и 55,6% соответственно). Обращает на себя внимание высокая чувствительность C. krusei к кетоконазолу (93,8%), тогда как для C. albicans этот показатель составил 77,5%.   

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Микробиологический анализ смывов с поверхностей производственной среды подтвердил наличие грибковой обсемененности во всех рабочих зонах комплекса.

Корма выступают значимым резервуаром и вектором передачи микроорганизмов. Все исследованные пробы кормов были контаминированы плесневыми и дрожжеподобными грибами. Помимо микобиоты в образцах кормов были идентифицированы бактерии P. aeruginosa, C. freundii и E. aerogenes, а также выделены E. coli, P. vulgaris. 

Наибольший уровень микробного загрязнения выявлен в подстилочном материале, сообщества которого представлены как микромицетами, так и различными грамотрицательными бактериями. Среди дрожжевых грибов во всех пробах (100%) выделен C. albicans.

При сравнительной оценке частоты выделения дрожжеподобных грибов Candida обнаружены значительные межгрупповые различия. Пробы кормов и подстилочного материала характеризовались 100%-й контаминацией. Частота обнаружения грибов в смывах была выше (36%), чем в пробах воздуха (22%). Полученные различия высоко значимы (p < 0,001), что указывает на приоритетную роль кормов и подстилки как резервуара Candida spp. по сравнению с объектами воздушной среды и смывами.

Полученные данные подтверждают природную устойчивость C. krusei к флуконазолу (чувствительность 56,3%, что для данного вида считается относительно высоким показателем на фоне литературных данных) и низкую чувствительность C. albicans к этому азолу (30,0%), что может свидетельствовать о селекции резистентных штаммов в популяции. Отсутствие значимых различий (p > 0,05) между видами, вероятно, обусловлено малым объемом выборки C. glabrata (n = 9) и C. krusei (n = 16).

Литературные данные о чувствительности C. krusei к итраконазолу противоречивы и демонстрируют значительную межштаммовую вариабельность — от высокой активности in vitro до полной резистентности. Это указывает на отсутствие видоспецифичной восприимчивости [10−12].

Резистентность C. glabrata к флуконазолу имеет многофакторный характер и реализуется через гиперэкспрессию эффлюксных насосов (вследствие мутаций PDR1) и мутации в гене-мишени ERG11. Ведущим механизмом является активное выведение препарата из клетки, а изменение последовательности ERG11 усиливает устойчивость. Это обусловливает частое отсутствие клинического ответа на флуконазол и требует назначения эхинокандинов [13−15].

ВЫВОДЫ

Полученные результаты демонстрируют системное загрязнение производственной среды животноводческого комплекса потенциально патогенными грибами с формированием устойчивых микробных сообществ в ключевых объектах (корма, подстилка). Выявленная полирезистентность циркулирующих штаммов дрожжеподобных грибов к распространенным антимикотикам (устойчивость более чем к четырем препаратам) указывает на необходимость разработки специализированных мер контроля.

Чувствительность дрожжей к антимикотическим препаратам в контексте стандартов CLSI — это способность микроорганизмов подавлять видимый рост при определенных условиях испытаний in vitro. Выявленная резистентность к азоловой группе препаратов обусловливает необходимость их исключения из профилактических схем применения в животноводстве во избежание снижения эффективности противогрибковых мероприятий. В качестве альтернативных антигрибковых препаратов можно предложить препараты полиеновой группы и эхинокандины.

Учитывая потенциальную обратимость резистентности дрожжей к антимикотикам и положительный опыт ротации средств в смежных областях, обоснованной представляется стратегия последовательной смены противогрибковых препаратов для преодоления устойчивости Candida spp. при кандидозах.

Представленные в исследовании санитарно-микробиологические подходы к оценке грибковой контаминации на производственных объектах животноводства имеют выраженную комплексную профилактическую направленность, позволяющую улучшить условия труда работников ферм, а также организовать мероприятия по оздоровлению производственной среды животноводческого комплекса.