Горнорудная промышленность является одной из ведущих отраслей экономики Российской Федерации. По данным Федеральной службы государственной статистики, в этой отрасли заняты более 1 млн человек. Это обуславливает актуальность сохранения здоровья работников, занятых на производстве по добыче металлических руд (в первую очередь подземным способом). Функционирование металлургических предприятий основывается на комплексе взаимодействующих технологических этапов, охватывающих добычу руды, ее обогащение, стадию металлургического передела, дальнейшую переработку, погрузочно-разгрузочные операции и транспортировку сырья и металлических продуктов. Однако в контексте промышленного производства данной сферы основным процессом является извлечение сырьевых ресурсов с целью их последующей переработки, что предопределяет ключевые вредные и опасные факторы производственной среды и трудового процесса, влияющие на состояние здоровья работников подземной добычи [1, 2].

Подземные горные работы характеризуются воздействием ряда специфических вредных и опасных факторов, включая воздействие пыли, химический и фракционный состав которой зависит от типа добываемой руды [3, 4]. Исследования показали, что дисперсионный состав пыли характеризуется присутствием частиц различного размера, в том числе ультрамелких (0,1–10 мкм). Такие частицы могут оказывать прямое отрицательное воздействие на критические органы и системы после перемещения частиц из легких в системный кровоток [5]. Способность частиц к перемещению обусловлена тем, что они приобретают слой абсорбированных белков с образованием уникальной короны, которая позволяет им преодолевать аэрогематический (воздушно-кровяной) барьер [6]. После попадания в кровоток частицы достигают чувствительных рецепторов, расположенных в критических органах и системах, таких как печень, селезенка, сердце, почки, лимфатические узлы и головной мозг, а затем инициируют нарушения метаболических процессов на клеточно-молекулярном уровне [7, 8].

Для изучения токсического действия химических веществ и раннего выявления негативных эффектов на начальных этапах их развития широко применяются постгеномные технологии, в том числе протеомика [9, 10]. Исследование изменений экспрессии белков и пептидов необходимо для понимания физиологических процессов и нарушений баланса гомеостаза на клеточно-молекулярном уровне [11]. Выявленные изменения белкового состава биосред (плазмы, сыворотки, мочи и т. д.) позволяют изучить реакции молекулярно-динамического равновесия организма и механизмы возникновения и развития негативных эффектов при действии вредных и опасных факторов производственной среды, в том числе химического фактора [12, 13].

Целью работы были ранее выявление и оценка негативных эффектов у работников предприятия горнорудной промышленности, подвергающихся воздействию металлов с воздухом рабочей зоны, посредством исследования белков-мишеней.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследовании, которое проводили с 14 апреля 2024 г. по 15 апреля 2025 г., приняли участие 113 сотрудников предприятия горнорудной промышленности. Критериями включения в группу наблюдения и группу сравнения были мужской пол; возраст 30–65 лет; стаж работы на предприятии — год и более; удовлетворительные гигиенические условия и социально-экономический уровень проживания; для группы наблюдения — профессиональная деятельность, связанная с подземной добычей медно-никелевых руд; для группы сравнения — деятельность, не связанная с вредными и опасными факторами производственной среды и трудового процесса. Критериями исключения были наличие острых инфекционных заболеваний в течение четырех недель до начала исследования; прием лекарственных препаратов, оказывающих выраженное влияние на предполагаемые органы-мишени, менее чем за 30 дней до начала исследования. В соответствии с указанными критериями в группу наблюдения были включены 39 работников (мужчин), занятых в сфере подземной добычи медно-никелевых руд, следующих основных профессий: горнорабочий очистного забоя, взрывник, бурильщик шпуров, проходчик, крепильщик, машинист погрузочно-доставочных работ, машинист буровой установки. Стаж работы на предприятии составил 18,2 ± 1,0 лет, средний возраст — 47,95 ± 0,87 лет. В группу сравнения вошли 74 работника административного аппарата предприятия. Стаж работы группы составил 17,1 ± 1,05 лет, средний возраст — 47,1 ± 0,83 лет (p ≤ 0,05 относительно группы наблюдения в обоих случаях). Группа наблюдения и группа сравнения были сопоставимы по вышеуказанным критериям и различались по наличию экспозиции вредных и опасных факторов производственной среды.

Отбор проб крови осуществляли на базе профпатологического отделения краевого центра профессиональной патологии КГБУЗ «Краевая киническая больница» г. Красноярска (зав. отделением О. Н. Захаринская, врач-профпатолог А. В. Галиулина). Анализ полученных проб выполнен на базе ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения».

Факт экспозиции работников подтверждали посредством химико-аналитического исследования концентрации шести металлов (кобальта, марганца, меди, никеля, свинца, хрома), содержащихся в виде ионов в супернатанте, выделенном из цельной крови. Отбор крови из локтевой вены осуществляли с помощью одноразового устройства натощак. Супернатант получали путем разрушения форменных элементов крови с помощью лизирующего буфера в соотношении 3 : 10, двухкратного центрифугирования при 14 000 об./мин в течение 10 мин, декантирования (отделения твердой фазы от жидкой). Количественное определение металлов выполняли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ISP-MS) в соответствии c МУК 4.1.3230-14, МУК 4.1.3161-14 на масс-спектрометре Agilent 7500cx (Agilent Technologies; США). Результаты оценивали относительно значений показателей группы сравнения. Применение супернатанта в качестве биосубстрата в исследовании обусловлено более высокой концентрацией белков по сравнению с цельной кровью.

Протеомное исследование предполагало получение пептидных образцов из супернатанта крови обследованных работников. Супернатант подвергали 2D-электрофорезу в полиакриламидном геле в сочетании с окраской серебром с помощью системы PROTEAN I12 IEF System и камеры для вертикального электрофореза PROTEAN II XL (Bio-Rad; США). Интенсивность белковых пятен определяли с помощью системы гель-документирования GeL Doc XR+ (Bio-Rad; США). Сравнительный анализ протеомных карт (по критерию интенсивности) групп наблюдения и сравнения выполнен с помощью программного обеспечения PDQuest (Bio-Rad; США). Значимо различающиеся белковые пятна вырезали и последовательно анализировали методами ВЭЖХ на хроматографе UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific; США) и тандемной масс-спектрометрии на масс-спектрометре 4000 QTRAP (AB Sciex; США). Полученные спектры обрабатывали с помощью программы ProteinPilot (AB Sciex; США) с идентификацией по базе данных UniProt и выборкой по таксону Homo sapiens (Human). Оценка нарушений метаболических процессов выполнена с помощью общедоступных биоинформационных ресурсов: UniProt (http://www.uniprot.org), Comparative Toxicogenomics Database (http://ctdbase.org/) и DisGeNET (https://www.disgenet.org/dbinfo).

Анализ результатов выполнен путем статической обработки информации с использованием программы Statistica 10 (StatSoft; США) с учетом определения статистической значимости различий (U-критерий Манна–Уитни, p ≤ 0,05). Метод регрессионного анализа использовали для построения моделей, отражающих причинно-следственные связи «концентрация металлов в супернатанте — изменение интенсивности белкового пятна». Для оценки статистической адекватности модели использовали коэффициент детерминации (R²) и критерий Фишера (F > 3,96). Критерий Стьюдента (p ≤ 0,05) применяли для проверки статистической значимости модели.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Длительная среднесменная экспозиция металлами (кобальтом, марганцем, медью, никелем, свинцом, хромом) с воздухом рабочей зоны на уровне 0,004–0,2 мг/м³ (0,1–4 ПДК_р.з.) обуславливает повышение концентрации данных веществ в супернатанте крови в 1,4–2,6 раза относительно аналогичных показателей группы сравнения (p = 0,000–0,011; табл. 1).

Доля работников с повышенным содержанием в крови металлов в группе наблюдения относительно группы сравнения составила 66,4–95,4% от общего числа обследованных лиц.

По результатам количественного анализа протеомных карт супернатанта крови выявлены 46 белковых пятен, демонстрирующих различия интенсивности между группами наблюдения и сравнения. Сравнительный анализ интенсивности указанных пятен позволил выявить значимые различия для 33 из них. Установлено увеличение синтеза в 1,1–26,3 раза для 15 белковых пятен (p = 0,000–0,021) и снижение в 1,2–38,8 раза для 18 пятен (p = 0,000–0,033). Масс-спектрометрическая идентификация показала, что обнаруженные аминокислотные последовательности совпадают с 80 белками из банка библиотеки масс-спектрометрических данных ProteinPilot.

Для 15 белковых пятен из 33 выявленных получены модели зависимости вероятности изменения интенсивности при одновременном повышении концентрации всех элементов (кобальта, хрома, никеля, меди и марганца) в супернатанте крови. Это позволило обосновать входящие в состав этих белковых пятен белки как индикаторные (табл. 2).

Методом биоинформационного анализа установлены гены, кодирующие выявленные индикаторные белки и ассоциированные с ними заболевания. Показано, что изменение экспрессии этих генов играет определенную роль в патогенезе негативных эффектов у работников с повышенным содержанием изучаемых металлов в супернатанте — в первую очередь эффектов со стороны нервной (гены MAP3K9, HLA-A, LDLR, LAMP2, AKT2, FNDC3B, FRRS1L, SPTBN4) и сердечно-сосудистой (гены MAP3K9, HLA-A, LDLR, LAMP2, HRH1) систем, органов пищеварения (гены LDLR, LAMP2, AKT2). Инициация этих изменений определяет нарушения на молекулярно-клеточном уровне, показателем которых является изменение экспрессии выявленных белков-мишеней (табл. 3).

Таким образом, полученные результаты показывают, что в патогенезе развития заболеваний, ассоциированных с воздействием повышенного содержания металлов в супернатанте крови работников подземной добычи медно-никелевых руд, могут участвовать выявленные белки-мишени. Мониторинг экспрессии данных белков необходим для прогнозирования развития негативных эффектов, обусловленных воздействием изучаемых металлов с воздухом рабочей зоны, а также для разработки мер профилактики таких эффектов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Деятельность на горнорудном предприятии оказывает значительное влияние на здоровье работников подземной добычи из-за присутствия в воздухе рабочей зоны металлов и их соединений в виде пыли и аэрозолей [3, 4]. Ультрамелкие частицы могут задерживаться в альвеолах легких, далее проникают в кровоток, где депонируют в различных органах и тканях [5]. На этом пути перенос частиц осуществляется с помощью абсорбированных на них белков и других биомолекул, которые обеспечивают их проникновение в клеточные структуры [6]. Проведенный протеомный анализ выявил белки MAP3K9, HLA-A, LDLR, LAMP2, AKT2, FNDC3B, FRRS1L, SPTBN4, HRH1, играющие патогенетическую роль в развитии негативных эффектов и связанных с ними нарушений метаболических процессов, которое влечет за собой повышение частоты случаев производственно-обусловленных заболеваний.

Известно, что развитие негативных эффектов инициирует воздействие ионов металлов на белковые мишени через усиление генерации активных форм кислорода (АФК), которое обеспечивает повышение или снижение их экспрессии. Повреждение белков ухудшает активность ферментов, что приводит к повышению уровня эндогенных клеточных перекисей водорода и короткоживущих АФК, оказывающих существенное влияние на липидный, белковый и углеводный обмен [14]. Обнаруженный в данном исследовании белок MAP3K9 участвует в каскадах клеточных ответов, вызванных изменениями в окружающей среде. Кроме того, он задействован в сигнальном пути, вызванном гибелью митохондрий (включая высвобождение цитохрома С) и приводящем к окислительному стрессу и апоптозу [15]. Биологические функции другого белка, LAMP2, являются спорными. Считается, что он в значительной степени вовлечен в работу лизосом, включая поддержание целостности, pH и катаболизма. Кроме того, одной из функций LAMP2 является защита лизосомальной мембраны от протеолитических ферментов и метилирующих мутагенов, приводящих к развитию окислительного стресса [16].

Воздействие металлов также повышает риск развития метаболического синдрома, характеризующегося гипертонией, непереносимостью инсулина, центральным ожирением и дислипидемией [17]. Считается, что этот эффект связан с чрезмерным окислительным стрессом, возникающим из-за воздействия металлов [18]. Выявленный белок AKT2 играет важную роль в контроле гликогенеза, глюконеогенеза и транспорта глюкозы как части пути передачи сигнала инсулина [19]. Белок LDLR опосредует эндоцитоз богатых холестерином липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и таким образом поддерживает их уровень в плазме [20]. Изменение экспрессии данного белка значимо коррелирует с повышением уровня ЛПНП в организме, которое приводит к развитию атеросклероза, метаболического синдрома и стеатогепатита [21]. Белок FNDC3B может быть положительным регулятором адипогенеза [22]. Однако аномальный адипогенез может приводить к патологическим состояниям, таким как ожирение, инсулинорезистентность и другие метаболические нарушения [23].

В структуре нозологических форм нарушений здоровья с временной утратой трудоспособности работников предприятий горнорудной промышленности наибольший удельный вес имеют болезни нервной системы [24]. Обнаруженный белок FRRS1L участвует в сигнальном пути глутамата (главный возбуждающий нейромедиатор) [22]. Повышение экспрессии данного белка может приводить к чрезмерной возбудимости нейронов. Другой белок, HRH1, опосредует сокращение гладких мышц и увеличивает проницаемость капилляров за счет сокращения терминальных венул. Кроме того, он способствует нейротрансмиссии в центральной нервной системе (ЦНС) и тем самым регулирует циркадные ритмы, эмоциональную и локомоторную активность, а также когнитивные функции [25]. Белок SPTBN4 относится к спектринам — белкам-скаффолдам, связывающим плазматическую мембрану с актиновым цитоскелетом. Они играют решающую роль в определении формы клетки, расположения трансмембранных белков и организации органелл. Изменение синтеза белка SPTBN4 приводит к дисфункции ионных каналов в тканях нервной системы за счет нарушения работы цитоскелетного аппарата [26]. Комплекс HLA, в состав которого входит белок HLA-A, служит единственным связующим звеном между иммунной системой и внутриклеточным состоянием. Экспрессия данного комплекса вызывает нейрональные эффекты в таламусе и гиппокампе, которые приводят к функциональным нарушениям в головном мозге [27, 28].

Полученные результаты подчеркивают важность интеграции протеомного анализа в оценку воздействия химических веществ для обнаружения ключевых молекулярных точек и механизмов развития неблагоприятных исходов с целью разработки мер ранней профилактики производственно-обусловленных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Длительная среднесменная аэрогенная экспозиция металлами (кобальтом, хромом, никелем, медью и марганцем) с воздухом рабочей зоны на уровне 0,004–0,2 мг/м³ (до4 ПДК) обуславливает повышение концентрации этих веществ в супернатанте крови работников основных профессий подземной добычи медно-никелевых руд до 2,6 раза.
2. Выявленная трансформация протеомного профиля супернатанта крови работников (увеличение экспрессии до 26,3 раза в 15 белковых патнах и снижение до 38,8 раза в 18 пятнах) обусловлена повышенной концентрацией указанных металлов в организме.
3. Экспрессия рассмотренных белков ассоциирована с развитием ряда негативных эффектов, в первую очередь, со стороны нервной (гены MAP3K9, HLA-A, LDLR, LAMP2, AKT2, FNDC3B, FRRS1L, SPTBN4) и сердечно-сосудистой (гены MAP3K9, HLA-A, LDLR, LAMP2, HRH1) систем, органов пищеварения (гены LDLR, LAMP2, AKT2), что подтверждает факт развития нарушений на молекулярно-клеточном уровне.
4. Идентифицированные белки-мишени участвуют в патогенезе окислительного стресса, метаболических и нейродегенеративных нарушений, что может обуславливать повышение частоты производственно-обусловленных заболеваний, связанных с воздействием металлов с воздухом рабочей зоны, у работников подземной добычи медно-никелевых руд.
5. Полученные результаты подчеркивают важность интеграции протеомного анализа в оценку воздействия металлов на работников подземной добычи медно-никелевых руд для раннего выявления изменений ключевых молекулярных точек и оценки механизмов развития неблагоприятных исходов с целью разработки мер ранней профилактики производственно-обусловленных заболеваний.