Синтетические неферментные антиоксиданты широко используют практически во всех сферах жизни и деятельности человека, и их значимость постоянно возрастает. Их действие направлено на ингибирование окислительного действия свободных радикалов и других веществ,   поскольку окислительные процессы могут ухудшать  свойства полимерных материалов, масел, используемых в промышленности, снижать качество продуктов пищевой промышленности и т. д. [1–3]. Антиоксиданты играют важную роль в комплексном подходе к лечению и профилактике заболеваний, позволяющем скорректировать диету и предотвратить ряд патологических процессов в организме [4].

Антиоксиданты активно применяют в качестве пищевых добавок для улучшения стабильности пищевых продуктов. Они обеспечивают продление сроков хранения продуктов, сохранение питательной ценности, натурального цвета и аромата. Антиоксиданты входят в состав фармацевтических и косметических препаратов, их используют в животноводстве при производстве кормов для животных и для повышения продуктивности [5–9] .

Кроме естественных антиоксидантов, примером которых является витамин Е в продуктах питания, существуют антиоксиданты, полученные посредством органического синтеза, т. е. синтетические, такие как пропилгаллат (PG, E310), третичный бутилгидрохинон (TBHQ, Е319), бутилгидроксианизол (ВНА, E320) и бутилгидрокситолуол (BHT, E321). Последний, BHT (butylated hydroxytoluene), или агидол-1, является одним из широко востребованных синтетических антиоксидантов.

Его применяют для производства нефтепродуктов, синтетических каучуков, пластмасс, эластомеров, масел, восков, мыла, краски и чернил [1, 2]. Агидол-1 — синтетический аналог витамина Е, зарегистрирован и лицензирован для косметических средств и упаковочных материалов, пищевых продуктов и кормов животных. Так, в косметологии его используют в качестве добавки при изготовлении суппозиториев, кремов, гелей, а также средств по уходу за кожей лица [10–12]. При производстве косметических, парфюмерных и фармацевтических препаратов, пищевых продуктов (пищевая добавка E321) требуется использование агидола-1, имеющего спецификацию «Вулканокс-BHT GMP Grade», что обеспечивает микробиологическую чистоту продукта и качество, соответствующее стандартам ХАССП (HACCP, Hazard Analysis and Critical Control Points GMP.

Агидол-1 в качестве пищевой добавки E321 широко используют при производстве различных  кондитерских изделий, молочных продуктов, безалкогольных и содержащих алкоголь напитков и т. д. Для пищевых продуктов установлены нормативы содержания пищевой добавки E321, составляющие 100–200 мг/кг готового продукта,  и допустимое суточное поступление E321 с пищевыми продуктами в организм, составляющее 0,125–0,3 мг/кг/сутки [13–15].

Принимая во внимание широкое использование агидола-1 в качестве синтетического антиоксиданта и увеличение объемов его производства, необходима разработка гигиенического норматива (ориентировочный безопасный уровень воздействия, ОБУВ) в воздухе рабочей зоны, который в настоящее время отсутствует. В свою очередь, обоснование ОБУВ является необходимым требованием для создания оптимальных условий труда работников на химических, пищевых и химико-фармацевтических производствах.

Целью исследования было экспериментальное изучение токсичности и опасности агидола-1 для оценки его безопасности на производстве.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования стал бутилированный гидрокситолуол (Butylated Hydroxytoluene, Butylhydroxytoluenum, ВНТ) — ароматический углеводород, производное фенола (C₁₅H₂₄O). Его химические названия: 2,6-бис(1,1-диметилэтил)-4-метилфенол; 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол; 2,6-ди-трет-бутил-4-гидрокситолуол; 2,6-ди-трет-бутил-4-крезол. Синонимы: дибунол, ионол. CAS: 128-37-0, молекулярная масса 220,35 г/моль. Торговые названия: агидол-1 кристаллическая марка А; пищевая добавка E321. Это белое кристаллическое вещество без запаха или с характерным слабым запахом. Т_пл = 69–73 °С. Практически не растворим в воде, растворим в 96%-м спирте, ацетоне, органических растворителях, сложных эфирах, жирах [16–19].

Определение дисперсности пылевых частиц агидола-1 показало, что образец исследуемого вещества однороден, в основном состоит из крупных частиц (1000 мкм и более), отмечено присутствие небольшого количества частиц средних размеров (около 20–100 мкм); соотношение первых и вторых 9 : 1. Для ингаляционного воздействия использовали смесь частиц вещества после механического измельчения: частицы размером 50–200 мкм (70%), 10–50 мкм (20%) и менее 10 мкм (10%).

Экспериментальные исследования параметров токсикометрии и   прогнозирование уровней безопасного воздействия на производстве проводили, руководствуясь действующими нормативными документами [20–23]. В экспериментах использованы лабораторные животные: нелинейные белые мыши и белые крысы, морские свинки-альбиносы, кролики породы шиншилла (филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Животных, прошедших карантин в течение 10 дней, содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму.

Параметры токсикометрии (DL₅₀) агидола-1 определяли при введении вещества в желудок мышам обоего пола (24 самца, 18 самок) и крысам самцам (18 особей), а также при внутрибрюшинном введении — мышам самцам (24 особи). В группы по определению DL₅₀ включали по 6 особей. Средние смертельные дозы рассчитывали методом пробит-анализа в модификации В. Б. Прозоровского.

Раздражающее действие изучали при однократном внесении 50 мг вещества в конъюнктивальный мешок глаза кроликов (3 особи), а раздражающее действие на кожу — при однократном и повторных нанесениях 500 мг вещества в виде взвеси в крахмальном геле (1 : 1) на депилированную кожу спины кролика (3 особи) на 4 ч. Кожно-резорбтивное действие вещества изучали на мышах самцах, опуская хвосты на 2/3 их длины во взвесь изучаемого соединения в крахмальном геле, т. е. «пробирочным методом». Хвосты контрольных мышей погружали в крахмальный гель. Контрольная и подопытная группа состояли из 6 особей каждая. Аппликации проводили в течение 2 ч ежедневно в течение 4 недель (5 дней в неделю). Кумулятивную активность агидола-1 оценивали на мышах самцах при ежедневном внутрижелудочном введении взвеси вещества в крахмальном геле в возрастающих дозах в течение 24 дней по методу Лима и соавт. [24]. Начальная доза составила 150 мг/кг (0,1 DL₅₀). Контрольные животные получали внутрижелудочно крахмальный гель. Экспериментальные группы состояли из 10 особей.

Принимая во внимание невысокую температуру плавления (69–73 ºС)  изучаемого агидола-1, проведено изучение ингаляционной опасности вещества в условиях статической ингаляции. Однократные ингаляции беспородных крыс-самцов проводили в специальных герметичных камерах объемом 200 л в течение 4 ч. Каждая группа состояла из восьми особей. Для регистрации проявлений интоксикации крыс оценивали интегральные параметры (масса тела, температура тела), показатели функционального состояния отдельных органов и систем (нервной, сердечно-сосудистой и дыхательной систем), состав периферической крови, функции печени и почек.

Для изучения функционального состояния нервной системы использовали оценку суммационно-порогового показателя (СПП) по методу С. В. Сперанского [22] и комплекса  поведенческих реакций в тестах «открытое поле» и «темная камера с отверстиями» (ТКСО) [23].  Регистрировали частоту дыхания (ЧД), частоту сердечных сокращений (ЧСС), проводили измерение артериального давления (АД), а также определяли ректальную температуру тела. В периферической крови на гемоанализаторе BC-2800 Vet (Mindray; Китай) регистрировали количество эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов и тромбоцитов, уровень гематокрита и компонентов лейкоцитарной формулы: относительное содержание лимфоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и базофилов.

Для оценки функционального состояния печени подопытных животных определяли содержание в сыворотке крови глюкозы, общего белка, альбуминов и общего холестерина, а также активность ферментов (аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ)). Функциональное состояние почек оценивали по величине диуреза за 17 ч после 4% водной нагрузки, по содержанию белка и хлоридов в моче, а также определяли pH мочи, содержание мочевины и электролитов (Na, K и Ca) в сыворотке крови и в моче.  Концентрацию электролитов определяли на пламенном фотометре ПФМ (ЗОМЗ; СССР). Для определения pH мочи использовали автоматический рН-метр Kelilong (Kelilong; Китай) для малых количеств мочи.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы StatTech («Статтех»; Россия) для определения статистически значимых различий наблюдаемых реакций подопытных и контрольных животных при воздействии препарата с использованием t-критерия Стьюдента, руководствуясь 95% (р > 0,05) уровнем доверительной вероятности с учетом числа животных, используемых в каждом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение параметров острой токсичности при внутрижелудочном введении  выявило межвидовые различия в восприимчивости крыс и мышей к агидолу-1. DL₅₀ для крыс превышала 5000 мг/кг (4-й класс опасности, малоопасные вещества, ГОСТ 12.1.007-76), для мышей-самцов она составила 1550 мг/кг, для мышей-самок — 2290 мг/кг (3-й класс опасности, умеренно опасные вещества, ГОСТ 12.1.007-76) (табл. 1). Гибель мышей отмечали на 5–8-й день после внутрижелудочного введения вещества. Клинические признаки интоксикации отсутствовали, отмечали только снижение массы тела (до 10–15%). При внутрибрюшинном введении мышам-самцам DL₅₀ составила 480 мг/кг (по классификации К. К. Сидорова вещество относится к 4-му классу малотоксичных веществ) [25] (табл. 1).

Агидол-1 не оказывал раздражающего действия на слизистые оболочки глаз и кожу (при однократном и повторном нанесении). Признаки кожно-резорбтивного и кумулятивного действия не установлены, однократное воздействие насыщающих паров агидола-1 не вызывало изменения общего состояния, поведения животных и функциональных показателей организма (ЧД, СПП, температуры тела).

Для определения минимально действующих концентраций (Lim_ac) были испытаны две концентрации аэрозоля агидола-1: 24,7 ± 5,6 мг/м³ и максимально достижимая — 67,8 ± 12,5 мг/м³. В ходе эксперимента гибели подопытных животных не наблюдали. Внешний вид и общее состояние подопытных и контрольных крыс не различались. Не отмечено влияние вещества на ректальную температуру тела и изученные физиологические показатели — ЧД, СПП, АД, ЧСС, поведенческие реакции.

При биохимическом изучении компонентов сыворотки крови животных не зарегистрировано повышение активности печеночных ферментов, а также уровня белка, альбуминов, холестерина, глюкозы, обмен и синтез которых происходит с участием печени (табл. 2). Функция почек также не была нарушена при ингаляции агидола-1 в обеих концентрациях: не отмечено значимых отличий биохимических показателей мочи подопытных групп от показателей  контрольных животных (табл. 3).

Содержание гемоглобина, количество эритроцитов, гематокрит, количество тромбоцитов и лейкоцитов периферической крови у крыс в подопытных группах и в контроле не различались (табл. 4). В лейкограмме подопытных крыс не отмечены отличия от контроля.

Таким образом, ингаляция агидола-1 в концентрациях 24,7 мг/м³ и 67,8 мг/м³ (максимально достижимая) не оказывала вредного воздействия на общее состояние животных, функциональное состояние нервной, сердечно-сосудистой и дыхательной систем, на состав периферической крови и биохимические параметры сыворотки крови и мочи. Порог острого ингаляционного действия в эксперименте не был установлен, следовательно, порог острого действия Lim_ac агидола-1 ˃ 67,8 мг/м³.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Представитель синтетических неферментных антиоксидантов агидол-1 широко применяют в различных отраслях промышленности, в том числе в химической, фармацевтической, пищевой промышленности, в медицине, животноводстве [15–17]. В связи с этим и была поставлена цель исследования — разработать безопасный уровень воздействия агидола-1 в воздухе рабочей зоны на производствах синтеза и его использование. По механизму действия агидол-1 подобен природному витамину Е, он также является донором атома водорода и превращает пероксидные радикалы в гидропероксиды, при этом молекула агидола-1 деактивирует две молекулы пероксидных радикалов. Будучи синтетическим аналогом витамина Е, он тем не менее эффективно подавляет автокаталитические процессы радикального окисления различных материалов и продуктов.

Агидол-1 легко всасывается через желудочно-кишечный тракт. После длительного употребления пищи, содержащей антиоксидант, он накапливается в жировой ткани и в печени с периодом полувыведения 7–10 дней. Агидол-1 выводится в основном с мочой и в меньшей степени с калом [13]. Изучение дисперсности представленного образца агидола-1 показало, что он практически однороден по размеру частиц и представлен в основном очень крупными частицами — около 1000 мкм и более. Соотношение частиц больших и средних размеров составляет 9 : 1, что может свидетельствовать об отсутствии способности проникать в нижние отделы  дыхательной системы и об элиминации агидола-1 в верхних отделах. Вещество практически не растворимо в воде, что также затрудняет поступление его в ткань легких. Полученные данные по дисперсности позволяют предполагать отсутствие отрицательного эффекта аэрозоля агидола-1 при ингаляционном поступлении.

Экспериментальные данные по токсикометрии и изучению опасности вещества являются подтверждением этого. Показано, что по величине острой токсичности (DL₅₀) при внутрижелудочном введении мышам и крысам агидол-1 относится к умеренно и малоопасным веществам (3-й и 4-й класс опасности, ГОСТ 12.1.007-76) соответственно, что полностью согласуется с данными литературы [18, 26–28]. Агидол-1 не оказывал раздражающего эффекта на кожу и слизистые глаза кролика, кожно-резорбтивное действие и кумулятивная активность отсутствовали в эксперименте.

Согласно данным литературы агидол-1 и агидол-0  (2,6-ди-трет-бутилфенол, базовый сырьевой продукт для получения агидола-1 и других эффективных фенольных антиоксидантов) не обладают кожно-резорбтивным и кумулятивным действием. Имеющиеся в литературе сведения о раздражающих свойствах агидола-1 несколько различаются. Большинство авторов отмечают слабое раздражающее действие на слизистые оболочки глаз и кожу кроликов [13, 16, 28, 29], однако ряд исследователей констатирует его отсутствие [26, 30]. Однократное воздействие насыщающих паров агидола-1 не вызывает изменения поведения и функциональных показателей организма животных (ЧД, СПП, температура тела).

Анализ данных литературы свидетельствует о том, что длительный или повторный прием ВНТ (агидола-1) в высоких дозах внутрь может оказывать влияние на функцию и структуру легких, печени, почек, приводить к гиперфункции щитовидной железы, надпочечников, вызывать изменение состава периферической крови (количества эритроцитов), состава сыворотки крови, а также приводить к потере веса. По мнению авторов, основным органом-мишенью агидола-1 является печень вследствие его липофильности. При хроническом пероральном воздействии BHT в дозах выше 25 мг/кг массы тела/день наблюдались увеличение печени и индукция ряда печеночных ферментов [31]. В связи с этим при проведении ингаляций ориентировались на биохимические показатели функционального состояния печени и почек, не исключая обследование других жизненно важных органов и систем организма.

Исследования показали, что динамическое ингаляционное воздействие аэрозоля агидола-1 в концентрациях 24,7 мг/м³и 67,8 мг/м³ (максимально достижимая концентрация) в течение 4 ч не оказывало общего токсического действия: не были отмечены отклонения в  состоянии нервной, сердечно-сосудистой и дыхательной систем, а также изменения функции печени, почек и состава периферической крови крыс.

Многочисленные экспериментальные и клинические данные однозначно подтверждают, что агидол-1 не обладает сенсибилизирующим действием. Вещество не классифицируют как мутаген и канцероген. Агидол-1 не обладает избирательным действием на репродуктивную систему,  поскольку минимальное эмбриотоксическое действие (снижение массы тела плодов) было отмечено в хронических экспериментах при воздействии доз, токсичных для материнского организма [13, 16, 18, 26, 28, 30, 31].

При обосновании ОБУВ агидола-1, если не установлен порог острого ингаляционного воздействия даже при максимально достижимой концентрации, необходимо обратиться к нормированным аналогам вещества или к утвержденным нормативам этого вещества в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. В отечественной литературе имеются данные о токсичности и опасности трех алкилфенольных антиоксидантов марки «Агидол» (агидол-0, агидол-1, агидол-10), а также приведена их сравнительная токсикологическая характеристика. Результатом этих исследований явились оценка безопасности этих веществ и рекомендации безопасных уровней воздействия в  атмосферном воздухе населенных мест [30]. Научно обоснованные ПДК для трех соединений марки «Агидол» (ПДК среднесуточная — 0,6 мг/м³, ПДК максимальная разовая — 2,0 мг/м³, 4-й класс опасности) утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ [32]. Наряду с этим в различных странах (США, Германия, Великобритания, Дания) для BHT (бутилированный гидрокситолуол) установлены предельно допустимые уровни профессионального воздействия (TLV, ACGIH, PEL — NIOSH, МАК — Европа). Их величины находятся в диапазоне концентраций от 2 мг/м³  до 10 мг/м³, однако в большинстве стран действует гигиенический норматив 10 мг/м³ [28].

ВЫВОДЫ

Проведенные исследования показали, что агидол-1 относится к малотоксичным и малоопасным веществам, не обладает раздражающим действием при однократном внесении в глаз и повторном нанесении на кожу. Опираясь на отсутствие общих токсических эффектов при ингаляции агидола-1 в проведенном исследовании, с учетом утвержденной величины ПДК трех соединений марки «Агидол» в атмосферном воздухе и гигиенических нормативов профессионального воздействия агидола-1 в различных странах, предложен ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ) в воздухе рабочей зоны 10 мг/м³, аэрозоль, 4-й класс опасности. Рекомендованная величина  была рассмотрена и утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ. Контроль агидола-1 в воздухе рабочей зоны осуществляется методом спектрофотометрии в диапазоне  концентраций 5,0–40,0 мг/м³ , длина волны — 278 нм.